2016年《PLOS ONE》的一组大肠杆菌实验显示,0.675%苯氧乙醇与0.075%乙基己基甘油单用30分钟,均未降低可培养菌数;相同浓度联用后,存活菌数下降超过5个对数单位。
乙基己基甘油简称EHG。研究使用大肠杆菌ATCC 11229,通常将细胞置于pH 7.5的磷酸钠缓冲液中。除另有说明外,实验在不同日期使用新制备的菌液和溶液重复三次。
单用与联用的差异先出现在培养计数中
研究者分别设置EHG、苯氧乙醇及二者组合的处理组。比较时,组合中每一种材料的浓度与相应单用组对应,处理时间也相同,因此可以观察加入另一种材料后,可培养菌数发生了怎样的变化。
处理结束后,研究者先中和抗菌剂,再将样品涂布于培养基上,培养后计算菌落形成单位。这项测量关注的是处理后仍能形成菌落的细胞,构成论文图1中杀菌结果的依据。
30分钟的结果说明,在该组浓度和实验条件下,单独使用两种材料与将它们组合使用,得到的存活结果存在明显差别。解释EHG的增效作用,还需要观察计数之外的细胞变化。
EHG使细胞膜的屏障状态发生变化
细胞膜限制细胞内外物质的进出。研究者通过染料进入细胞、细胞内物质泄漏到外部溶液等测量,观察处理后的膜完整性。染料进入与内部物质逸出,分别呈现屏障变化的两个方向。
染色观察在处理3小时和24小时后进行。24小时时,经0.075%EHG处理的细胞,其膜对染料的通透性与0.675%苯氧乙醇处理组相近或更高。这一观察对应较长的处理时间,需与30分钟的菌数结果分别阅读。
DNA泄漏实验中,研究者处理细胞后离心去除细菌,再测量上清液中的DNA,并以裂解细胞所得的总DNA作参照。这样,细胞内部物质出现在外部溶液中的程度就能被单独观察。
研究发现,EHG在较低浓度下也能损伤膜屏障。膜功能受到影响的细胞,仍可能保持形成菌落的能力;因此,膜检测出现变化与可培养菌数没有下降可以同时出现。
DNA泄漏怎样与存活结果对照
论文图2给出了一组具体对照:处理30分钟时,1.35%苯氧乙醇在致死条件下产生的DNA泄漏,与0.15%EHG尚未造成细胞死亡时的泄漏可以相近。相似的泄漏程度,对应了不同的存活结果。
这组对照让膜变化与杀菌结果之间的关系更清楚。DNA泄漏显示屏障对细胞内部物质的限制受到影响,可培养菌数则显示细胞处理后能否继续形成菌落。判断两者关系,需要对照各项检测使用的浓度和时间。
作者结合膜检测与计数结果,将EHG的增效与膜完整性损伤联系起来:EHG能影响细胞膜,与苯氧乙醇共同处理后,研究观察到快速杀菌。图1中的单用、联用计数与图2中的泄漏结果,分别提供了组合效果和膜作用的证据。
